Calpastatin Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-419474-ACT

Il gene Cast del topo codifica la calpastatina, l’inibitore endogeno delle proteasi calpaine calcio‑dipendenti, che limita la proteolisi controllata di substrati del citoscheletro e della segnalazione. Modulando l’attività delle calpaine, la calpastatina contribuisce a regolare il rimodellamento del citoscheletro, il turnover delle adesioni focali, il traffico di membrana e l’apoptosi, con effetti a valle sulla segnalazione infiammatoria e sulle risposte allo stress. L’equilibrio CAST–calpaine è ampiamente rilevante per l’integrità dei tessuti nel muscolo e nel sistema nervoso e, secondo la letteratura, la sua disregolazione è stata collegata a meccanismi alla base di miopatie, neurodegenerazione e alterata attivazione delle cellule immunitarie. In modelli cellulari e animali, la modulazione dell’espressione di Cast viene utilizzata per analizzare programmi di rimodellamento guidati da proteasi e reti di segnalazione calcio‑dipendenti.

Calpastatin Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Cast senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Calpastatin Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Cast nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Cast, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Calpastatin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Cast nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Calpastatin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Calpastatin nelle cellule tumorali con espressione di Cast silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.