Calnexin Plasmide di attivazione CRISPR (m2): sc-419436-ACT-2

Il gene murino Canx codifica la calnexina, uno chaperone di membrana del reticolo endoplasmatico (RE) che lega glicani N-linked monoglucosilati per favorire il ripiegamento, l’assemblaggio e la ritenzione delle glicoproteine nascenti all’interno del ciclo calnexina/calreticolina. La calnexina svolge un ruolo nel controllo qualità del RE e nella proteostasi coordinandosi con ERp57 e ossidoreduttasi correlate, influenzando la formazione dei ponti disolfuro, la degradazione associata al RE (ERAD) e la risposta alle proteine mal ripiegate durante lo stress del RE. L’alterazione della sorveglianza del ripiegamento dipendente da Canx può compromettere l’omeostasi della via secretoria ed è stata collegata, in modelli murini in cui la maturazione delle glicoproteine è cruciale, a fenotipi rilevanti per il neurosviluppo, la mielinizzazione e la funzione immunitaria. L’editing genetico di Canx supporta studi meccanicistici sulla biogenesi delle glicoproteine, sulla segnalazione dello stress del RE e sul traffico di proteine di membrana e secrete in diversi tipi cellulari e in contesti pertinenti alle malattie.

Calnexin Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Canx senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Calnexin Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Canx nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Canx, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Calnexin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Canx nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Calnexin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Calnexin nelle cellule tumorali con espressione di Canx silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.