BTLA Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-431543-ACT

Btla codifica per il B and T lymphocyte attenuator (BTLA), un immunorecettore inibitorio della famiglia CD28 che limita l’attivazione dei linfociti e contribuisce a mantenere la tolleranza periferica. La segnalazione di BTLA viene avviata dal legame con HVEM (TNFRSF14) e recluta fosfatasi tramite i motivi ITIM/ITSM per attenuare la segnalazione prossimale al recettore dell’antigene, riducendo la produzione di citochine, la proliferazione e la differenziazione effettrice. Nelle cellule immunitarie murine, BTLA contribuisce alla regolazione di programmi simili all’esaurimento delle cellule T, delle risposte del centro germinativo e al controllo dei segnali infiammatori all’interno dei tessuti linfoidi. Le alterazioni delle vie di BTLA sono ampiamente rilevanti negli studi su autoimmunità, infiammazione cronica, rimodellamento immunitario guidato dalle infezioni e immunologia tumorale nel contesto della biologia dei checkpoint immunitari.

BTLA Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Btla senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

BTLA Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Btla nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Btla, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di BTLA. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Btla nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da BTLA nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via BTLA nelle cellule tumorali con espressione di Btla silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.