BTBD12 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404395-ACT

SLX4 (BTBD12) codifica una proteina scaffold multifunzionale che coordina endonucleasi specifiche per la struttura durante la riparazione dei crosslink interfilamentari del DNA e la risoluzione di intermedi di replicazione bloccati. Integra attività di segnalazione ed enzimatiche lungo la via dell’anemia di Fanconi e della ricombinazione omologa, sostenendo la stabilità del genoma durante la fase S e il recupero dallo stress replicativo. BTBD12 interagisce con complessi nucleasici quali XPF–ERCC1, MUS81–EME1 e SLX1 per promuovere incisioni appropriate del DNA e il processamento delle giunzioni di Holliday. L’alterazione o la deregolazione delle reti di riparazione collegate a SLX4 è associata a fenotipi di instabilità cromosomica e a difetti della risposta al danno al DNA rilevanti per il cancro, rendendolo un nodo utile per lo studio delle vie di stress genotossico.

BTBD12 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLX4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

BTBD12 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLX4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLX4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di BTBD12. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLX4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da BTBD12 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via BTBD12 nelle cellule tumorali con espressione di SLX4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.