BNPI Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403333-ACT

SLC17A7 codifica il trasportatore vescicolare del glutammato BNPI (VGLUT1), una proteina di membrana delle vescicole sinaptiche che carica il glutammato nelle vescicole per sostenere il rilascio quantale del neurotrasmettitore nelle sinapsi eccitatorie. Controllando l’impacchettamento presinaptico del glutammato, BNPI influenza la trasmissione sinaptica, la plasticità dipendente dall’attività e l’equilibrio eccitazione–inibizione nei circuiti neurali. La funzione di SLC17A7 è strettamente legata a vie di segnalazione neuronale che modellano apprendimento e memoria, inclusi i processi che regolano il ciclo delle vescicole, l’omeostasi dei neurotrasmettitori e l’eccitabilità dei circuiti. Alterazioni della segnalazione glutammatergica che coinvolgono SLC17A7 sono state studiate in relazione a fenotipi neuroevolutivi e neuropsichiatrici, nonché alla suscettibilità alle crisi e ai meccanismi di stress eccitotossico.

BNPI Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC17A7 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

BNPI Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC17A7 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC17A7, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di BNPI. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC17A7 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da BNPI nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via BNPI nelle cellule tumorali con espressione di SLC17A7 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.