ATG7 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-428805-ACT

Il gene murino **Atg7** codifica **ATG7**, un enzima di tipo E1 che catalizza reazioni di coniugazione “ubiquitin-like” essenziali per la formazione degli autofagosomi. ATG7 attiva **ATG12** e le proteine della famiglia **LC3/Atg8** per promuovere l’espansione del fagoforo, il sequestro del carico e il flusso autofagico, collegando il sensing dei nutrienti al turnover lisosomiale. Grazie al suo ruolo centrale nella macroautofagia, ATG7 influenza il controllo di qualità mitocondriale, la proteostasi e la segnalazione dell’immunità innata; la sua disregolazione è comunemente utilizzata per modellare fenotipi dipendenti dall’autofagia in neurodegenerazione, stress metabolico, biologia delle infezioni e adattamento cellulare rilevante per il cancro. Nei sistemi murini, la perturbazione di **Atg7** è ampiamente impiegata per studiare il crosstalk della via con la segnalazione **mTOR/AMPK**, le risposte allo stress del RE e i programmi trascrizionali associati all’infiammazione.

ATG7 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Atg7 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ATG7 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Atg7 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Atg7, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ATG7. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Atg7 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ATG7 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ATG7 nelle cellule tumorali con espressione di Atg7 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.