Plasmide CRISPR d'Activation (m) ATG7: sc-428805-ACT

Le gène murin Atg7 code ATG7, une enzyme de type E1 qui catalyse des réactions de conjugaison de type ubiquitine indispensables à la formation des autophagosomes. ATG7 active ATG12 et les protéines de la famille LC3/Atg8 afin de favoriser l’expansion du phagophore, la séquestration du cargo et le flux autophagique, reliant ainsi la détection des nutriments au renouvellement lysosomal. Par son rôle central dans la macroautophagie, ATG7 influence le contrôle qualité des mitochondries, la protéostasie et la signalisation de l’immunité innée, et sa dérégulation est couramment utilisée pour modéliser des phénotypes dépendants de l’autophagie dans la neurodégénérescence, le stress métabolique, la biologie des infections et l’adaptation cellulaire pertinente pour le cancer. Dans les systèmes murins, la perturbation d’Atg7 est largement employée pour étudier les interactions (crosstalk) avec la signalisation mTOR/AMPK, les réponses au stress du RE et les programmes transcriptionnels associés à l’inflammation.

ATG7 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Atg7 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ATG7 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Atg7 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Atg7, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ATG7. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Atg7 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ATG7 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ATG7 dans les cellules tumorales présentant une expression de Atg7 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.