ARG1/Arginase 1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-418076-ACT

ARG1 umano codifica l’arginasi 1, un metalloenzima citosolico che catalizza la conversione della L-arginina in L-ornitina e urea, costituendo la fase terminale del ciclo dell’urea e un regolatore chiave dell’eliminazione dell’azoto. Controllando la disponibilità intracellulare di arginina, ARG1 influenza la biosintesi di poliammine e prolina attraverso il flusso di ornitina e può modulare indirettamente la sintesi di ossido nitrico tramite la competizione con le ossido nitrico sintasi. L’attività di ARG1 è strettamente legata all’omeostasi metabolica degli epatociti e ai programmi immunometabolici nelle cellule mieloidi, dove la deplezione di arginina può plasmare la reattività delle cellule T e la segnalazione infiammatoria. Un’espressione o una funzione deregolata di ARG1 è associata a disturbi della detossificazione dell’ammoniaca ed è stata implicata nella biologia mieloide associata ai tumori e in altri contesti in cui il metabolismo dell’arginina viene rimodellato.

ARG1/Arginase 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ARG1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ARG1/Arginase 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ARG1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ARG1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ARG1/Arginase 1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ARG1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ARG1/Arginase 1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ARG1/Arginase 1 nelle cellule tumorali con espressione di ARG1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.