APPL1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402243-ACT

APPL1 (adaptor protein, phosphotyrosine interacting with PH domain and leucine zipper 1) è un adattatore endosomiale citosolico che collega il traffico di membrana alla trasduzione del segnale a valle di recettori quali i recettori dell’adiponectina e le vie dell’insulina/IGF. Legandosi a Rab5 e ai fosfoinositidi e attivando la segnalazione di AKT e AMPK, APPL1 modula la dinamica endosomiale, l’omeostasi del glucosio e le risposte cellulari agli stimoli metabolici. La segnalazione dipendente da APPL1 influenza proliferazione, sopravvivenza e risposte allo stress ossidativo attraverso PI3K–AKT e reti correlate. Un’espressione o una funzione alterata di APPL1 è stata associata a insulino-resistenza e a fenotipi di sindrome metabolica, ed è spesso studiata in contesti che collegano endocitosi e segnalazione oncogenica e cardiometabolica.

APPL1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di APPL1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

APPL1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus APPL1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione APPL1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di APPL1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus APPL1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da APPL1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via APPL1 nelle cellule tumorali con espressione di APPL1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.