ANO4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-406887-ACT

L’ANO4 umano (anoctamina 4) codifica un membro della famiglia TMEM16/anoctamine di proteine di membrana multipasso, implicate nel trasporto di anioni e fosfolipidi attraverso le membrane cellulari. L’attività di ANO4 è stata collegata al rimodellamento della membrana regolato dal Ca2+, inclusi processi come lo “scrambling” dei fosfolipidi che possono influenzare il traffico vescicolare, la segnalazione cellulare e le risposte allo stress. Attraverso questi ruoli, ANO4 si inserisce in vie che accoppiano la dinamica del calcio intracellulare a cambiamenti nella composizione della membrana e nell’eccitabilità. Un’alterata funzione della famiglia TMEM16, inclusa ANO4, è di interesse in studi su fenotipi neurologici, biologia delle piastrine e delle cellule immunitarie, e adattamenti della segnalazione di membrana associati al cancro.

ANO4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ANO4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ANO4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ANO4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ANO4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ANO4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ANO4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ANO4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ANO4 nelle cellule tumorali con espressione di ANO4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.