AMPKγ2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404970-ACT

PRKAG2 codifica la subunità regolatoria AMPKγ2 della proteina chinasi attivata da AMP (AMPK), un sensore energetico centrale che collega lo stato cellulare AMP/ATP all’adattamento metabolico. Modulando l’assemblaggio del complesso AMPK e il riconoscimento dei nucleotidi, AMPKγ2 influenza le vie a valle che controllano l’assorbimento di glucosio, l’ossidazione degli acidi grassi, la biogenesi mitocondriale e l’autofagia, attraverso nodi di segnalazione quali mTORC1 e ULK1. PRKAG2 è altamente rilevante per la bioenergetica del muscolo cardiaco e scheletrico, dove alterazioni della segnalazione AMPK possono modificare l’utilizzo dei substrati e le risposte allo stress. La variazione genetica o la disregolazione di PRKAG2 è stata associata a fenotipi di conduzione cardiaca e ipertrofici, supportandone l’impiego in studi meccanicistici sul rimodellamento metabolico ed elettrofisiologico.

AMPKγ2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PRKAG2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

AMPKγ2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PRKAG2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PRKAG2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di AMPKγ2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PRKAG2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da AMPKγ2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via AMPKγ2 nelle cellule tumorali con espressione di PRKAG2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.