AKAP 2 Plasmide di attivazione CRISPR (m2): sc-419065-ACT-2

Il gene murino Akap2 codifica la proteina di ancoraggio della A-chinasi 2 (AKAP2), uno scaffold che organizza spazialmente la protein-chinasi A (PKA) e i componenti di segnalazione associati, conferendo risposte al cAMP specifiche del compartimento. Reclutando la PKA in siti subcellulari definiti, AKAP2 influenza reti di fosforilazione che regolano la dinamica del citoscheletro, la polarità cellulare, il traffico di membrana e programmi trascrizionali dipendenti dal contesto a valle della segnalazione del cAMP. L’alterazione o la deregolazione dei microdomini di PKA ancorata da AKAP è rilevante per studi sulla segnalazione nello sviluppo, sull’eccitabilità di neuroni e cardiomiociti e, più in generale, sui meccanismi di deregolazione della segnalazione implicati in fenotipi associati a malattia. I flussi di lavoro di gene-editing e di genomica funzionale su Akap2 consentono di indagare la compartimentalizzazione della PKA, mappare le interfacce di interazione proteina–proteina e validare readout cellulari dipendenti dalle vie di segnalazione in modelli murini e in sistemi cellulari ingegnerizzati.

AKAP 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Akap2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

AKAP 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Akap2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Akap2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di AKAP 2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Akap2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da AKAP 2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via AKAP 2 nelle cellule tumorali con espressione di Akap2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.