β ig-h3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403770-ACT

TGFBI codifica β ig-h3 (TGFBIp), una proteina secreta della matrice extracellulare indotta dalla segnalazione del TGF-β, che modula l’adesione cellula–matrice, la migrazione e il rimodellamento tissutale attraverso interazioni con integrine e matrici ricche di collagene. Contribuisce all’organizzazione della ECM, alla dinamica delle adesioni focali e a vie a valle collegate alla transizione epitelio-mesenchimale e alla riparazione delle ferite. Un’espressione disregolata di TGFBI è stata associata a processi legati alla fibrosi e al rimodellamento del microambiente tumorale, rendendolo rilevante per lo studio della motilità cellulare, dell’invasione e del crosstalk stroma–epitelio. Inoltre, varianti di TGFBI e un’alterata deposizione della proteina sono implicate nelle distrofie corneali e in altri fenotipi guidati dalla ECM.

β ig-h3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TGFBI senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

β ig-h3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TGFBI nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TGFBI, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di β ig-h3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TGFBI nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da β ig-h3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via β ig-h3 nelle cellule tumorali con espressione di TGFBI silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.