ZIP4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-412558-ACT

SLC39A4 codifica il trasportatore umano di zinco ZIP4, una proteina di membrana multipasso che media l’assorbimento cellulare di Zn2+ extracellulare e contribuisce a mantenere l’omeostasi metabolica e di segnalazione dipendente dallo zinco. L’attività di ZIP4 sostiene processi che includono la differenziazione epiteliale, l’integrità della barriera e programmi trascrizionali responsivi ai metalli, con effetti a valle sulle risposte allo stress ossidativo e sulle vie di sintesi proteica che richiedono lo zinco come cofattore strutturale o catalitico. Un’espressione o una funzione disregolata di SLC39A4 altera la disponibilità di zinco ed è stata associata a disturbi dell’assorbimento dello zinco e a fenotipi più ampi che coinvolgono crescita, funzione immunitaria e mantenimento dei tessuti epiteliali. Poiché lo zinco influenza numerosi enzimi e fattori di trascrizione, ZIP4 è spesso studiato come regolatore a monte delle reti di rilevamento dei nutrienti e di adattamento allo stress.

ZIP4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC39A4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ZIP4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC39A4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC39A4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ZIP4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC39A4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ZIP4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ZIP4 nelle cellule tumorali con espressione di SLC39A4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.