Y14 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403255-ACT

RBM8A codifica la proteina umana legante l’RNA Y14, un componente centrale del complesso di giunzione degli esoni (exon junction complex, EJC) che viene depositato sull’mRNA dopo lo splicing e coordina le fasi successive del metabolismo dell’RNA. Y14 partecipa al decadimento dell’mRNA mediato da codoni di stop prematuri (nonsense-mediated mRNA decay, NMD), all’esportazione dell’mRNA e alla regolazione della traduzione, influenzando così il controllo qualità dei trascritti e l’omeostasi dell’espressione genica. Attraverso queste funzioni, RBM8A incide su vie legate alla progressione del ciclo cellulare, alla regolazione dei geni dello sviluppo e all’elaborazione dell’RNA in risposta allo stress. La disregolazione dell’attività dell’EJC e della sorveglianza dell’RNA associata a RBM8A è stata collegata a splicing aberrante e a una stabilità dei trascritti alterata osservati in diversi contesti rilevanti per la malattia, inclusi programmi di espressione genica neuro-sviluppativi e associati al cancro.

Y14 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RBM8A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Y14 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RBM8A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RBM8A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Y14. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RBM8A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Y14 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Y14 nelle cellule tumorali con espressione di RBM8A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.