xCT Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401920-ACT

SLC7A11 umano codifica xCT, la subunità a catena leggera del sistema xC⁻ che media l’importazione di cistina indipendente dal sodio in scambio con glutammato intracellulare. Fornendo cistina per la sintesi del glutatione, xCT sostiene l’omeostasi redox cellulare, la detossificazione delle specie reattive dell’ossigeno e l’accoppiamento metabolico tra trasporto di amminoacidi e capacità antiossidante. SLC7A11 è regolato da programmi di risposta allo stress come NRF2 e dalla segnalazione integrata dello stress, collegandolo alla sensibilità alla ferroptosi e, più in generale, al metabolismo dei tioli. Un’attività disr egolata di xCT è stata associata a un’alterata gestione dello stress ossidativo e al rimodellamento metabolico osservati in diversi contesti rilevanti per la malattia, inclusi la biologia tumorale e i processi neuroinfiammatori.

xCT Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC7A11 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

xCT Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC7A11 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC7A11, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di xCT. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC7A11 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da xCT nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via xCT nelle cellule tumorali con espressione di SLC7A11 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.