WDHD1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-408824-ACT

WDHD1 (proteina 1 con ripetizioni WD e dominio HMG-box legante il DNA) è un fattore conservato di replicazione e mantenimento del genoma che coordina l’inizio della replicazione del DNA, l’avanzamento della forcella replicativa e la risposta allo stress replicativo. Nelle cellule umane, WDHD1 supporta l’organizzazione del replisoma e la corretta progressione della fase S, collegando la sintesi del DNA ai checkpoint e ai processi di riparazione che preservano l’integrità del genoma. Un’espressione o attività deregolata di WDHD1 è associata a fenotipi proliferativi ed è stata riportata in molteplici contesti tumorali, in linea con il suo ruolo nel sostenere un rapido transito del ciclo cellulare. In quanto regolatore associato alla cromatina della dinamica di replicazione, WDHD1 è spesso studiata in vie che governano la segnalazione del danno al DNA, la stabilità delle forcelle di replicazione e la segregazione cromosomica.

WDHD1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di WDHD1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

WDHD1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus WDHD1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione WDHD1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di WDHD1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus WDHD1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da WDHD1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via WDHD1 nelle cellule tumorali con espressione di WDHD1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.