WBSCR16 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-413429-ACT

RCC1L (WBSCR16) codifica una proteina mitocondriale simile a RCC1, implicata nel coordinare la biogenesi dei ribosomi mitocondriali e nel sostenere la capacità di fosforilazione ossidativa. Attraverso effetti sull’assemblaggio del mitoribosoma e sul metabolismo dell’RNA mitocondriale, WBSCR16 contribuisce a mantenere la proteostasi mitocondriale e un funzionamento efficiente della catena di trasporto degli elettroni. L’alterazione di questa via può modificare l’omeostasi energetica cellulare, le risposte mitocondriali allo stress e la segnalazione a valle legata all’adattamento metabolico. WBSCR16 è stata studiata nel contesto di fenotipi di disfunzione mitocondriale ed è rilevante per ricerche meccanicistiche su disturbi che coinvolgono una traduzione e una respirazione mitocondriali compromesse.

WBSCR16 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RCC1L senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

WBSCR16 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RCC1L nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RCC1L, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di WBSCR16. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RCC1L nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da WBSCR16 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via WBSCR16 nelle cellule tumorali con espressione di RCC1L silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.