VPS25 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404109-ACT

Il gene umano **VPS25** codifica una subunità centrale del complesso **ESCRT-II**, che coordina lo smistamento endosomiale e la biogenesi dei corpi multivescicolari, consentendo il traffico delle proteine di membrana ubiquitinate verso la degradazione lisosomiale. Attraverso il rimodellamento di membrana dipendente da ESCRT, VPS25 contribuisce alla downregulation dei recettori, all’omeostasi delle proteine di membrana e, più in generale, al controllo dell’intensità e della durata della segnalazione. La macchina ESCRT interagisce anche con la citochinesi e con le dinamiche di membrana legate all’autofagia, collegando la funzione di VPS25 alla divisione cellulare e alla proteostasi adattativa in condizioni di stress. La disregolazione del traffico endosomiale-lisosomiale e dei componenti della via ESCRT è associata ad alterazioni della segnalazione dei fattori di crescita, a un turnover proteico compromesso e a fenotipi cellulari rilevanti per neurodegenerazione e cancro.

VPS25 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di VPS25 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

VPS25 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus VPS25 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione VPS25, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di VPS25. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus VPS25 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da VPS25 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via VPS25 nelle cellule tumorali con espressione di VPS25 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.