VPS13A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-407168-ACT

VPS13A codifica la proteina 13A associata allo smistamento delle proteine vacuolari (vacuolar protein sorting-associated protein 13A), un grande fattore di trasferimento lipidico che si localizza nei siti di contatto tra membrane e sostiene l’omeostasi dei lipidi, la dinamica degli organelli e il traffico vescicolare. VPS13A è implicata nella comunicazione tra mitocondri e reticolo endoplasmatico, in processi legati all’autofagia e nel mantenimento dell’integrità delle membrane neuronali ed eritrocitarie attraverso la regolazione della distribuzione dei fosfolipidi. L’alterazione della funzione di VPS13A è associata a fenotipi neurodegenerativi e alla biologia dei disturbi del movimento, inclusa la patogenesi della corea-acantocitosi, ed è sempre più studiata anche nel contesto delle risposte cellulari allo stress e del rimodellamento delle membrane. Di conseguenza, VPS13A rappresenta un punto di accesso meccanicistico per indagare le vie che collegano il trasporto intracellulare alla funzione mitocondriale e alla neurobiologia.

VPS13A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di VPS13A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

VPS13A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus VPS13A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione VPS13A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di VPS13A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus VPS13A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da VPS13A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via VPS13A nelle cellule tumorali con espressione di VPS13A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.