Vangl2 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-430058-ACT

Vangl2 (Van Gogh-like 2) codifica una componente fondamentale della via della polarità planare delle cellule (PCP, planar cell polarity), che coordina comportamenti cellulari polarizzati nei tessuti durante lo sviluppo del topo. In quanto proteina di membrana con quattro passaggi transmembrana, Vangl2 contribuisce all’organizzazione di complessi PCP asimmetrici con partner come Frizzled/Dishevelled e Prickle, influenzando l’estensione convergente, la divisione cellulare orientata e la migrazione collettiva. La segnalazione dipendente da Vangl2 si interseca con le vie Wnt non canoniche per regolare la dinamica del citoscheletro e la morfogenesi tissutale. Una funzione di Vangl2 deregolata è associata a difetti della PCP e a fenotipi dello sviluppo, incluse anomalie della chiusura del tubo neurale, rendendolo un bersaglio utile per analizzare processi guidati dalla polarità.

Vangl2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Vangl2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Vangl2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Vangl2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Vangl2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Vangl2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Vangl2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Vangl2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Vangl2 nelle cellule tumorali con espressione di Vangl2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.