USP18 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402259-ACT

USP18 umano codifica per la ubiquitin specific peptidase 18, una deISGilasi inducibile dagli interferoni che rimuove ISG15 dai substrati proteici e agisce come un regolatore negativo chiave della segnalazione dell’interferone di tipo I. Modulando la dinamica dell’ISGilazione e attenuando l’output della via JAK–STAT tramite interazioni con IFNAR2, USP18 plasmando i programmi antivirali, la risposta alle citochine e l’omeostasi dell’immunità innata. Un’attività alterata di USP18 è stata associata a firme interferoniche deregolate e fenotipi infiammatori, ed è spesso studiata in contesti quali la restrizione virale, l’elusione immunitaria e le interazioni tra tumore e sistema immunitario. Di conseguenza, USP18 rappresenta un nodo utile per analizzare il crosstalk tra modificazioni post-traduzionali, risposte trascrizionali all’interferone e proteostasi.

USP18 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di USP18 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

USP18 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus USP18 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione USP18, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di USP18. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus USP18 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da USP18 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via USP18 nelle cellule tumorali con espressione di USP18 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.