Usherin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-409699-ACT

USH2A codifica usherina, una grande proteina transmembrana associata alla matrice extracellulare, arricchita negli epiteli sensoriali, dove supporta l’architettura e la meccanotrasduzione dei fotorecettori e delle cellule ciliate dell’orecchio interno. L’usherina partecipa all’organizzazione delle reti proteiche di Usher e contribuisce alle interazioni cellula–cellula e cellula–matrice che stabilizzano i fasci di stereociglia e il complesso di membrana periciliare. Attraverso questi ruoli, USH2A è collegato a processi che regolano la ciliogenesi, l’adesione e il traffico intracellulare nelle cellule polarizzate. Le alterazioni genetiche di USH2A sono fortemente associate a degenerazioni retiniche ereditarie e a fenotipi sindromici udito/visione, rendendolo un locus chiave per lo studio dei meccanismi di mantenimento e degenerazione delle cellule sensoriali.

Usherin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di USH2A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Usherin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus USH2A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione USH2A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Usherin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus USH2A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Usherin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Usherin nelle cellule tumorali con espressione di USH2A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.