ULK3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403581-ACT

ULK3 codifica una protein-chinasi serina/treonina della famiglia delle chinasi simili a unc-51, che coordina eventi di segnalazione legati alle risposte cellulari allo stress e a programmi trascrizionali regolati dai morfogeni. ULK3 è stata implicata nella modulazione dell’attività Hedgehog/GLI e nel cross-talk con vie che controllano l’autofagia, la dinamica del citoscheletro e la progressione del ciclo cellulare, sostenendo una regolazione dipendente dal contesto di proliferazione e differenziamento. Attraverso queste connessioni di rete, ULK3 viene studiata in modelli di regolazione dello sviluppo e di deregolazione delle vie di segnalazione rilevanti per la biologia del cancro e per fenotipi fibrotici. Un’espressione alterata di ULK3 o un output di segnalazione modificato possono quindi fungere da readout meccanicistico del “rewiring” delle vie in stati cellulari rilevanti per la malattia.

ULK3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ULK3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ULK3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ULK3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ULK3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ULK3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ULK3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ULK3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ULK3 nelle cellule tumorali con espressione di ULK3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.