UCH-L1 Particelle di Attivazione Lentivirale (h2): sc-401088-LAC-2

Il gene umano UCHL1 codifica l’enzima deubiquitinante UCH-L1, un’idrolasi del C-terminale dell’ubiquitina arricchita nei neuroni che mantiene l’omeostasi dell’ubiquitina elaborando i precursori dell’ubiquitina e i substrati ubiquitinati all’interno del sistema ubiquitina–proteasoma. L’attività di UCH-L1 contribuisce al controllo di qualità delle proteine, alla funzione sinaptica e all’integrità assonale, collegandola a vie che regolano la proteostasi, le risposte allo stress e la sopravvivenza neuronale. La disregolazione o le mutazioni di UCHL1 sono state associate a fenotipi neurodegenerativi e neurosviluppativi, inclusa la patologia correlata al morbo di Parkinson e alla malattia di Alzheimer, nonché neuropatie periferiche. L’editing genetico di UCHL1 supporta studi meccanicistici della segnalazione dell’ubiquitina, la modellizzazione di varianti rilevanti per la malattia in sistemi cellulari umani e la valutazione di come un’alterata deubiquitinazione influenzi l’aggregazione, lo stress mitocondriale e la differenziazione neuronale.

Le particelle di attivazione lentivirale UCH-L1 (h2) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di UCHL1 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale UCH-L1 (h2) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione UCHL1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di UCH-L1. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo UCHL1 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.