TTLL2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-413521-ACT

TTLL2 (tubulin tyrosine ligase–like 2) codifica un membro della famiglia di enzimi TTL-like implicati nella modificazione post-traduzionale della tubulina tramite poliglutamilazione, un processo che modula la dinamica dei microtubuli e l’interazione dei microtubuli con le proteine motrici e con le proteine associate ai microtubuli. Modulando la funzione dei microtubuli assonemali e citoplasmatici, TTLL2 può influenzare processi legati a ciglia/flagelli, il trasporto intracellulare e l’organizzazione del citoscheletro. Una poliglutamilazione della tubulina disregolata è stata collegata in letteratura ad alterazioni della motilità ciliare e a fenotipi di tipo neuroevolutivo e neurodegenerativo, a supporto di TTLL2 come utile bersaglio per lo studio dei meccanismi di malattia associati ai microtubuli. L’attività di TTLL2 nell’uomo è quindi rilevante per vie che regolano la stabilità dei microtubuli, la biologia delle ciglia e programmi di differenziamento specifici del tipo cellulare.

TTLL2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TTLL2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TTLL2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TTLL2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TTLL2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TTLL2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TTLL2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TTLL2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TTLL2 nelle cellule tumorali con espressione di TTLL2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.