TS Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402479-ACT

Il gene umano **TYMS** codifica la timidilato sintasi (TS), un enzima citosolico che catalizza la conversione *de novo* del dUMP in dTMP, fornendo una fonte essenziale di timidilato per la replicazione e la riparazione del DNA. Controllando la disponibilità di dTTP, la TS sostiene la progressione della fase S e influenza la stabilità del genoma attraverso il suo collegamento con il metabolismo a un carbonio/dipendente dai folati. L’attività di TYMS si integra con le reti di biosintesi dei nucleotidi e con le risposte allo stress replicativo, e la sua espressione alterata è spesso studiata in contesti di stati proliferativi e di tolleranza al danno al DNA. La disregolazione di TYMS è stata associata a cambiamenti nel controllo della crescita cellulare e nella riprogrammazione metabolica, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici dell’omeostasi dei nucleotidi.

TS Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TYMS senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TS Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TYMS nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TYMS, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TS. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TYMS nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TS nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TS nelle cellule tumorali con espressione di TYMS silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.