TRPV5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403668-ACT

TRPV5 codifica un canale cationico TRP altamente selettivo per il calcio, costitutivamente attivo, localizzato prevalentemente nella membrana apicale delle cellule epiteliali, dove media l’ingresso transcellulare di Ca2+. L’attività del canale è coordinata con i meccanismi di omeostasi del calcio, inclusi il buffering mediato dalla calbindina e l’estrusione basolaterale tramite lo scambiatore Na+/Ca2+ e le Ca2+-ATPasi, ed è modulata da fattori quali il Ca2+ intracellulare, il pH e la segnalazione calciotropica. La funzione di TRPV5 è strettamente connessa ai programmi di trasporto ionico epiteliale e alla fisiologia del riassorbimento del calcio, rendendolo un nodo rilevante per lo studio del metabolismo minerale e del trasporto attraverso le barriere epiteliali. Un’espressione o un’attività deregolata di TRPV5 è stata associata a fenotipi di alterata gestione del calcio ed è stata investigata in contesti di disturbi dell’equilibrio del calcio a livello renale e sistemico.

TRPV5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TRPV5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TRPV5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TRPV5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TRPV5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TRPV5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TRPV5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TRPV5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TRPV5 nelle cellule tumorali con espressione di TRPV5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.