Transketolase Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401941-ACT

Il gene umano **TKT** codifica la transchetolasi, un enzima dipendente dal pirofosfato di tiamina che catalizza reazioni reversibili di trasferimento di unità a due atomi di carbonio nel ramo non ossidativo della via dei pentosi fosfati. Interconvertendo il ribosio-5-fosfato e gli intermedi della glicolisi, la transchetolasi contribuisce a coordinare la biosintesi dei nucleotidi, l’equilibrio redox tramite l’accoppiamento a reazioni che producono NADPH e, più in generale, il flusso del carbonio durante la proliferazione e lo stress metabolico. L’attività di TKT influenza le risposte cellulari allo stress ossidativo e alla disponibilità di nutrienti, e un’alterata regolazione della via dei pentosi fosfati è stata associata al rimodellamento metabolico osservato in diversi contesti patologici, inclusi la biologia del cancro e i disordini metabolici ereditari. In quanto nodo centrale che collega glicolisi e metabolismo dei pentosi, TKT è spesso oggetto di studi in analisi a livello di via metabolica della domanda biosintetica, della capacità antiossidante e delle transizioni di stato cellulare.

Transketolase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TKT senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Transketolase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TKT nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TKT, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Transketolase. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TKT nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Transketolase nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Transketolase nelle cellule tumorali con espressione di TKT silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.