TPCN2 Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-402960-LAC

TPCN2 (two-pore channel 2) codifica un canale cationico endolisosomiale che regola il flusso intracellulare di ioni, con ruoli di rilievo nella segnalazione del Ca²⁺ dipendente da NAADP a partire da organelli acidi. Modellando la dinamica endosoma–lisosoma, il traffico vescicolare e l’eccitabilità degli organelli, TPCN2 influenza processi a valle tra cui l’autofagia, gli eventi di fusione di membrana e le cascate di segnalazione Ca²⁺-dipendenti. Variazioni dell’attività di TPCN2 sono state associate ad alterazioni della biologia della pigmentazione e a fenotipi metabolici; inoltre, la disregolazione della segnalazione endolisosomiale che coinvolge TPCN2 è rilevante negli studi sulla neurodegenerazione e sul comportamento delle cellule tumorali. Queste caratteristiche rendono TPCN2 un bersaglio utile per analizzare le reti di segnalazione lisosomiale e le risposte cellulari regolate dal Ca²⁺ in sistemi modello umani.

Le particelle di attivazione lentivirale TPCN2 (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di TPCN2 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale TPCN2 (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione TPCN2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di TPCN2. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo TPCN2 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.