TMEM55B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-410227-ACT

TMEM55B codifica una fosfatasi transmembrana dei fosfoinositidi implicata nella regolazione della segnalazione del fosfatidilinositolo, catalizzando la defosforilazione di substrati fosfoinositidici e influenzando così l’identità e il traffico di membrana. Attraverso la modulazione della composizione lipidica delle membrane endosomiali e lisosomiali, TMEM55B è collegata al trasporto vescicolare, al turnover dei recettori e a un controllo più ampio delle dinamiche di segnalazione intracellulare. Un’alterata omeostasi dei fosfoinositidi è associata a una deregolazione della crescita cellulare e delle risposte allo stress, rendendo TMEM55B rilevante per studi sul crosstalk tra vie di segnalazione che possono influire su proliferazione e sopravvivenza. Nei sistemi cellulari umani, l’espressione e l’attività di TMEM55B costituiscono un utile punto di accesso per indagare la regolazione, guidata dai lipidi, della funzione degli organelli e delle reti di segnalazione in contesti rilevanti per la malattia.

TMEM55B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TMEM55B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TMEM55B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TMEM55B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TMEM55B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TMEM55B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TMEM55B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TMEM55B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TMEM55B nelle cellule tumorali con espressione di TMEM55B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.