TMEM106C Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-413113-ACT

TMEM106C codifica una proteina transmembrana multipasso prevista, che si ritiene contribuisca all’organizzazione delle membrane e al traffico proteico all’interno del sistema secretorio ed endolisosomiale. In quanto membro della famiglia TMEM106, TMEM106C viene studiato nel contesto dell’omeostasi degli organelli, del trasporto vescicolare e della regolazione del turnover proteico, processi che si intersecano con le risposte cellulari allo stress e con le reti di segnalazione. Un’espressione alterata dei regolatori del traffico transmembrana può rimodellare la funzione lisosomiale, il flusso autofagico e la segnalazione infiammatoria o metabolica a valle. Questi meccanismi rendono TMEM106C un bersaglio utile per indagare come la dinamica dei compartimenti di membrana influenzi le transizioni di stato cellulare e i fenotipi associati a malattia in sistemi modello umani.

TMEM106C Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TMEM106C senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TMEM106C Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TMEM106C nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TMEM106C, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TMEM106C. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TMEM106C nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TMEM106C nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TMEM106C nelle cellule tumorali con espressione di TMEM106C silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.