TLR4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400068-ACT

Il TLR4 umano (Toll-like receptor 4) è un recettore di riconoscimento di pattern che rileva il lipopolisaccaride e altri pattern molecolari associati a patogeni e a danno (PAMP e DAMP) a livello della membrana plasmatica. In seguito al legame del ligando con co-recettori quali MD-2 e CD14, TLR4 avvia cascate di segnalazione dipendenti da MyD88 e TRIF che attivano NF-κB, AP-1 e IRF3, inducendo programmi trascrizionali per citochine infiammatorie e risposte di interferone di tipo I. Queste vie coordinano l’attivazione dell’immunità innata, il reclutamento leucocitario e il crosstalk con l’immunità adattativa tramite le cellule presentanti l’antigene. Una segnalazione di TLR4 deregolata è stata implicata in stati infiammatori cronici e in patologie immuno-mediate, ed è ampiamente studiata in contesti quali la sepsi, l’aterosclerosi, l’infiammazione metabolica e l’infiammazione associata ai tumori.

TLR4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TLR4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TLR4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TLR4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TLR4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TLR4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TLR4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TLR4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TLR4 nelle cellule tumorali con espressione di TLR4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.