TIMP-1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-423402-ACT

Il gene Timp1 del topo codifica l’inibitore tissutale delle metalloproteinasi-1 (TIMP-1), una glicoproteina secreta che si lega a diverse metalloproteinasi della matrice e le inibisce, regolando il turnover della matrice extracellulare e la proteolisi pericellulare. Attraverso il controllo dell’attività delle MMP, TIMP-1 influenza l’adesione cellulare, la migrazione e i processi di rimodellamento tissutale, che si intrecciano con la segnalazione infiammatoria e con i programmi di riparazione delle ferite. L’attività di TIMP-1 è comunemente studiata in contesti di fibrosi, infiammazione cronica e rimodellamento del microambiente tumorale, in cui un equilibrio alterato tra proteasi e inibitori contribuisce a una deposizione disfunzionale della matrice e all’invasione cellulare. In quanto regolatore extracellulare multifunzionale, TIMP-1 supporta anche studi meccanicistici sull’angiogenesi e sul crosstalk tra stroma e sistema immunitario in modelli murini.

TIMP-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Timp1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TIMP-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Timp1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Timp1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TIMP-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Timp1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TIMP-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TIMP-1 nelle cellule tumorali con espressione di Timp1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.