TCP-1 ζ CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403047-ACT

CCT6A kodiert die humane Untereinheit Zeta des Chaperonin-Containing TCP-1 (TCP‑1 ζ), eine zentrale Komponente des zytosolischen TRiC/CCT-Komplexes, der die ATP-abhängige Faltung von Aktin, Tubulin und weiteren Client-Proteinen vermittelt, die für die Proteostase erforderlich sind. Über seine Funktion in der Proteinkontrolle unterstützt TCP‑1 ζ die Organisation des Zytoskeletts, den Fortschritt des Zellzyklus und eine stressresponsive Homöostase, mit nachgelagerten Auswirkungen auf Prozesse wie die Integrität der mitotischen Spindel und den intrazellulären Transport. Störungen von TRiC/CCT-Untereinheiten können Signalnetzwerke, die mit Proliferation und Überleben verknüpft sind, neu ausrichten, und eine veränderte Expression von CCT6A wurde in mehreren krankheitsrelevanten Kontexten beschrieben, darunter krebsassoziierte Phänotypen und ein Ungleichgewicht der Proteostase. Daher wird CCT6A häufig in Signalwegen untersucht, die Chaperon-Kapazität, Zytoskelettdynamik und zelluläre Fitness unter Stress miteinander verbinden.

TCP-1 ζ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CCT6A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TCP-1 ζ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CCT6A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CCT6A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TCP-1 ζ-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CCT6A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TCP-1 ζ-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TCP-1 ζ-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CCT6A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.