TCP-1 ζ Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403047-ACT

CCT6A codifica la subunità zeta del chaperonina contenente TCP-1 umano (TCP-1 ζ), un componente centrale del complesso citosolico TRiC/CCT che media il ripiegamento ATP-dipendente di actina, tubulina e di ulteriori proteine client necessarie per la proteostasi. Attraverso il suo ruolo nel controllo di qualità proteico, TCP-1 ζ sostiene l’organizzazione del citoscheletro, la progressione del ciclo cellulare e l’omeostasi in risposta allo stress, con effetti a valle su processi quali l’integrità del fuso mitotico e il traffico intracellulare. La perturbazione delle subunità TRiC/CCT può rimodellare reti di segnalazione legate a proliferazione e sopravvivenza, e un’espressione alterata di CCT6A è stata riportata in molteplici contesti rilevanti per la malattia, inclusi fenotipi associati al cancro e squilibri della proteostasi. Di conseguenza, CCT6A è spesso studiato in vie che collegano la capacità chaperonica, la dinamica del citoscheletro e la fitness cellulare in condizioni di stress.

TCP-1 ζ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CCT6A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TCP-1 ζ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CCT6A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CCT6A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TCP-1 ζ. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CCT6A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TCP-1 ζ nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TCP-1 ζ nelle cellule tumorali con espressione di CCT6A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.