T-type Ca⁺⁺ CP α1I Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403786-ACT

CACNA1I codifica la subunità α1I del canale del calcio di tipo T CaV3.3, una proteina formante il poro attivata a basso voltaggio che media un influx transitorio di Ca2+ in prossimità dei potenziali di membrana a riposo. Modellando le depolarizzazioni sottosoglia e le scariche “rebound” a raffica, CaV3.3 contribuisce all’eccitabilità neuronale, alla scarica ritmica e alla segnalazione Ca2+-dipendente che collega l’attività di membrana ai programmi di trascrizione e di plasticità sinaptica. L’attività di CACNA1I si interseca con vie che controllano la dinamica del potenziale di membrana, l’omeostasi del calcio intracellulare e la regolazione genica dipendente dall’attività nei tessuti eccitabili. Studi genetici e funzionali hanno implicato variazioni o disregolazioni di CACNA1I in fenotipi neuropsichiatrici e del neurosviluppo, supportandone la rilevanza per lavori meccanicistici sulle oscillazioni a livello di circuito e sull’eccitabilità cellulare.

T-type Ca++ CP α1I Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CACNA1I senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

T-type Ca++ CP α1I Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CACNA1I nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CACNA1I, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di T-type Ca++ CP α1I. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CACNA1I nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da T-type Ca++ CP α1I nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via T-type Ca++ CP α1I nelle cellule tumorali con espressione di CACNA1I silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.