T-cadherin Plasmide di attivazione CRISPR (h2): sc-416752-ACT-2

Il gene umano CDH13 codifica la T-caderina (caderina-13), una caderina atipica ancorata tramite glicosilfosfatidilinositolo (GPI), priva di dominio transmembrana e citoplasmatico, che agisce come modulatore dell’adesione e della segnalazione sulla superficie cellulare. La T-caderina influenza le interazioni cellula–cellula, la crescita dei neuriti e l’organizzazione sinaptica, nonché il comportamento vascolare/endoteliale, integrando segnali che incidono sul rimodellamento del citoscheletro e su vie di segnalazione dipendenti dal contatto. Varianti di CDH13 e alterazioni della sua espressione sono state associate a fenotipi neuroevolutivi e neuropsichiatrici, oltre che a caratteristiche cardiometaboliche e vascolari, a sostegno della sua rilevanza per studi sulla connettività cerebrale e sulla disfunzione endoteliale. L’editing genetico di CDH13 consente di chiarire i meccanismi della segnalazione mediata dalle caderine indipendente dall’adesione, di mappare gli effetti delle varianti sulla localizzazione e sulla funzione della proteina e di sviluppare modelli cellulari per l’analisi delle vie di segnalazione e lo studio delle relazioni genotipo–fenotipo.

T-cadherin Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CDH13 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

T-cadherin Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CDH13 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CDH13, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di T-cadherin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CDH13 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da T-cadherin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via T-cadherin nelle cellule tumorali con espressione di CDH13 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.