Synaptojanin 2 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-423241-ACT

Il gene murino Synj2 codifica la sinaptojanina 2, una 5-fosfatasi dei fosfoinositidi che regola la segnalazione del fosfatidilinositolo defosforilando il PIP2 e lipidi correlati nelle membrane endocitiche. Attraverso il controllo dell’endocitosi mediata da clatrina, dell’internalizzazione dei recettori e del rimodellamento di membrana dipendente dall’actina, la sinaptojanina 2 contribuisce a coordinare il traffico vescicolare e la dinamica della segnalazione intracellulare. L’attività della famiglia delle sinaptojanine è strettamente legata al riciclo delle vescicole sinaptiche e, più in generale, all’omeostasi delle membrane neuronali; alterazioni del metabolismo dei fosfoinositidi sono state implicate in meccanismi di malattie del neurosviluppo e neurodegenerative. Synj2 viene inoltre studiato in contesti in cui il flusso endocitico e il turnover dei fosfoinositidi influenzano la segnalazione dei fattori di crescita e fenotipi di migrazione cellulare.

Synaptojanin 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Synj2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Synaptojanin 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Synj2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Synj2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Synaptojanin 2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Synj2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Synaptojanin 2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Synaptojanin 2 nelle cellule tumorali con espressione di Synj2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.