SR-2B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402574-ACT

L’HTR2B umano codifica il recettore della serotonina 2B (SR-2B), un recettore accoppiato a proteine G (GPCR) che si accoppia principalmente a Gq/11 per stimolare la segnalazione della fosfolipasi C, il turnover dei fosfati di inositolo, la mobilizzazione intracellulare di Ca2+ e l’attività della via MAPK/ERK dipendente da PKC. SR-2B modula programmi trascrizionali legati alla crescita cellulare, al rimodellamento della matrice extracellulare e alla dinamica del citoscheletro, integrando segnali serotoninergici con reti di segnalazione specifiche del tessuto. Alterazioni dell’espressione e della segnalazione di HTR2B sono state associate al rimodellamento cardiovascolare e alla biologia valvolare; inoltre, un’attività recettoriale modificata è stata riportata in diversi contesti neuropsichiatrici e fibrotici, a supporto di studi meccanicistici della fisiopatologia guidata dalla serotonina. Queste caratteristiche rendono SR-2B un bersaglio utile per indagare la trasduzione del segnale dei GPCR, la segnalazione “biased” del recettore e le risposte regolatorie a valle sull’espressione genica in modelli cellulari umani.

SR-2B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HTR2B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SR-2B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HTR2B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HTR2B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SR-2B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HTR2B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SR-2B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SR-2B nelle cellule tumorali con espressione di HTR2B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.