spectrin α II Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400910-ACT

SPTAN1 codifica la spetrina α II umana, un componente fondamentale dello scheletro di membrana spetrina–actina che sostiene l’integrità della membrana plasmatica e organizza l’architettura del citoscheletro corticale. La spetrina α II forma eterotetrameri con le β-spetrine, fungendo da impalcatura per canali ionici e complessi di segnalazione, e contribuendo a processi quali adesione cellulare, meccanotrasduzione e mantenimento della polarità cellulare. Attraverso le sue funzioni strutturali e di adattatore, SPTAN1 influenza vie dipendenti dal citoscheletro, inclusi il traffico di membrana, la stabilità delle giunzioni e la migrazione cellulare. La disregolazione delle reti di spetrina è stata associata ad alterazioni dell’omeostasi neuronale ed epiteliale ed è rilevante per studi sui disturbi del citoscheletro e sulle perturbazioni della segnalazione collegate a fenotipi di malattia.

spectrin α II Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SPTAN1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

spectrin α II Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SPTAN1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SPTAN1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di spectrin α II. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SPTAN1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da spectrin α II nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via spectrin α II nelle cellule tumorali con espressione di SPTAN1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.