SMG8 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-408902-ACT

SMG8 codifica un componente centrale del complesso SMG1C che regola il decadimento dell’mRNA mediato da nonsense (NMD), una via di sorveglianza dell’RNA conservata che riconosce e degrada i trascritti contenenti codoni di terminazione prematuri. Modulando l’attività chinasica di SMG1 e coordinando la dinamica di fosforilazione di UPF1, SMG8 contribuisce ad accoppiare la terminazione della traduzione al rimodellamento degli mRNP e al turnover mirato dell’mRNA. Attraverso questi meccanismi, SMG8 sostiene il controllo di qualità del trascrittoma, la proteostasi e programmi di espressione genica responsivi allo stress. Una NMD deregolata e perturbazioni del metabolismo dell’RNA legate a SMG8 sono state associate ad alterazioni dell’omeostasi cellulare e vengono studiate in contesti che includono fenotipi di neurosviluppo e cambiamenti nell’espressione genica rilevanti per il cancro.

SMG8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SMG8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SMG8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SMG8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SMG8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SMG8. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SMG8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SMG8 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SMG8 nelle cellule tumorali con espressione di SMG8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.