SMG8 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-408902-ACT

SMG8 kodiert eine zentrale Komponente des SMG1C-Komplexes, der den Nonsense-vermittelten mRNA-Abbau (NMD) reguliert – einen konservierten RNA-Überwachungsweg, der Transkripte mit vorzeitigen Terminationscodons erkennt und abbaut. Durch die Modulation der SMG1-Kinaseaktivität und die Koordination der UPF1-Phosphorylierungsdynamik trägt SMG8 dazu bei, die Translationsbeendigung mit dem Umbau von mRNPs und dem gezielten Abbau von mRNA zu koppeln. Über diese Mechanismen leistet SMG8 einen Beitrag zur Qualitätskontrolle des Transkriptoms, zur Proteostase und zu stressresponsiven Genexpressionsprogrammen. Eine dysregulierte NMD sowie mit SMG8 verknüpfte Störungen im RNA-Stoffwechsel wurden mit einer veränderten zellulären Homöostase in Verbindung gebracht und werden unter anderem im Kontext neurodevelopmentaler Phänotypen und krebsrelevanter Veränderungen der Genexpression untersucht.

SMG8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SMG8-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SMG8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SMG8-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SMG8-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SMG8-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SMG8-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SMG8-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SMG8-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SMG8-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.