SIK1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401769-ACT

La Salt-inducible kinase 1 (SIK1) è una chinasi serina/treonina della famiglia delle chinasi correlate ad AMPK che trasduce segnali dipendenti da cAMP/PKA per regolare programmi trascrizionali che controllano il metabolismo, la segnalazione circadiana e le risposte allo stress. SIK1 modula l’attività di CREB/CRTC e contribuisce al controllo, dipendente dalla fosforilazione, dei coattivatori trascrizionali, collegando segnali extracellulari a cambiamenti dell’espressione genica in molteplici tipi cellulari. Attraverso queste vie, SIK1 influenza l’omeostasi energetica cellulare, la differenziazione e le risposte adattative agli stimoli ambientali. Una deregolazione della segnalazione di SIK1 è stata associata ad alterazioni della regolazione metabolica e a un controllo trascrizionale aberrante in contesti rilevanti per la malattia, supportandone l’impiego in studi meccanicistici dell’accoppiamento tra segnalazione e trascrizione.

SIK1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SIK1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SIK1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SIK1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SIK1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SIK1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SIK1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SIK1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SIK1 nelle cellule tumorali con espressione di SIK1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.