Shh Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400225-ACT

SHH umano codifica Sonic hedgehog (Shh), un morfogeno secreto che coordina il patterning embrionale, la polarità dei tessuti e il comportamento delle cellule staminali/progenitrici attraverso la cascata di segnalazione Hedgehog. Shh si lega a PTCH1 alleviando la repressione di SMO, consentendo l’attivazione dei fattori di trascrizione GLI e dei programmi a valle che regolano proliferazione, differenziamento e organizzazione spaziale. Nei tessuti adulti, SHH contribuisce alle interazioni epitelio–mesenchimali e al mantenimento della nicchia; inoltre, una segnalazione Hedgehog disregolata è implicata in disturbi dello sviluppo e in contesti di segnalazione oncogenica. L’attività della via SHH è comunemente studiata per i suoi ruoli nello sviluppo del tubo neurale e degli arti, nell’organogenesi e nel controllo trascrizionale dipendente dal segnale.

Shh Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SHH senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Shh Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SHH nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SHH, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Shh. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SHH nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Shh nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Shh nelle cellule tumorali con espressione di SHH silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.