Scleraxis Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422833-ACT

Il gene Scx del topo codifica la scleraxis, un fattore di trascrizione basic helix–loop–helix che funge da regolatore di linea dei progenitori di tendini e legamenti e da driver chiave dei programmi genici della matrice extracellulare. La scleraxis coordina reti trascrizionali che controllano la differenziazione dei tenociti, la fibrillogenesi del collagene e l’organizzazione del citoscheletro in risposta a segnali di sviluppo e al carico biomeccanico, intersecando vie come TGF-β/SMAD, FGF e la segnalazione di meccanotrasduzione. Un’alterata espressione o attività di SCX è associata a un rimodellamento disordinato del tessuto connettivo, a una maturazione tendinea compromessa e a una deposizione di matrice di tipo fibrotico, rendendolo un nodo utile per lo studio dello sviluppo muscoloscheletrico e della biologia della riparazione dei tessuti molli.

Scleraxis Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Scx senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Scleraxis Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Scx nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Scx, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Scleraxis. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Scx nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Scleraxis nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Scleraxis nelle cellule tumorali con espressione di Scx silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.