SA-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403116-ACT

STAG1 codifica SA-1, una componente centrale del complesso della coesina che regola la coesione delle cromatidi sorelle, l’architettura della cromatina di ordine superiore e la comunicazione a lungo raggio tra enhancer e promotore. Attraverso i ruoli della coesina nella segregazione cromosomica e nella riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA, SA-1 contribuisce alla stabilità del genoma e alla progressione del ciclo cellulare, interfacciandosi con vie che controllano le risposte allo stress replicativo e i programmi trascrizionali. L’attività di STAG1 influenza l’espressione genica specifica di linea cellulare modellando i domini topologicamente associati (TAD) e facilitando il looping della cromatina regolato. La deregolazione delle subunità della coesina, incluso STAG1, è associata ad alterazioni del controllo trascrizionale e a instabilità cromosomica osservate in molteplici contesti di ricerca rilevanti per la malattia, inclusi il cancro e i meccanismi legati alle coesinopatie.

SA-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di STAG1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SA-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus STAG1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione STAG1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SA-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus STAG1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SA-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SA-1 nelle cellule tumorali con espressione di STAG1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.