SA-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403116-ACT

STAG1 codifica a SA-1, um componente central do complexo coesina, que regula a coesão entre cromátides-irmãs, a arquitetura da cromatina em níveis superiores e a comunicação de longa distância entre potenciadores (enhancers) e promotores. Por meio das funções da coesina na segregação cromossômica e no reparo de quebras de dupla fita do DNA, a SA-1 contribui para a estabilidade do genoma e a progressão do ciclo celular, interagindo com vias que controlam as respostas ao estresse replicativo e programas transcricionais. A atividade de STAG1 influencia a expressão gênica específica de linhagem ao moldar domínios de associação topológica (TADs) e facilitar o looping de cromatina regulado. A desregulação de subunidades da coesina, incluindo STAG1, está associada a controle transcricional alterado e instabilidade cromossômica observados em múltiplos contextos de pesquisa relevantes para doenças, incluindo câncer e mecanismos relacionados a coesinopatias.

SA-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de STAG1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SA-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus STAG1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição STAG1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SA-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus STAG1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SA-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SA-1 em células tumorais com expressão de STAG1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.