RyR-3 Plasmide di attivazione CRISPR (m2): sc-422776-ACT-2

Il gene murino Ryr3 codifica il recettore della rianodina 3 (RyR-3), un canale intracellulare di rilascio di Ca2+ localizzato principalmente nel reticolo endoplasmatico/sarcoplasmatico, che media il rilascio di calcio indotto dal calcio e modella i transitori di calcio citosolico. La segnalazione del Ca2+ dipendente da RyR-3 contribuisce all’accoppiamento eccitazione–contrazione, alla plasticità sinaptica e alla regolazione genica dipendente dall’attività modulando processi quali l’omeostasi del calcio, l’accoppiamento mitocondriale e le vie a valle collegate a CaMK/CREB. Un’alterata funzione di RyR-3 e la fuga di calcio mediata dai recettori della rianodina sono state implicate, in sistemi modello, in fenotipi neuroevolutivi e neurodegenerativi, nella suscettibilità alle crisi epilettiche e in difetti della fisiologia muscolare. L’editing mirato di Ryr3 nel topo supporta studi meccanicistici sulle dinamiche del calcio intracellulare, sull’elettrofisiologia e sulle risposte allo stress del RE, consentendo la validazione funzionale in modelli cellulari neuronali e muscolari e in circuiti genetici in vivo.

RyR-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Ryr3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RyR-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Ryr3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Ryr3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RyR-3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Ryr3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RyR-3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RyR-3 nelle cellule tumorali con espressione di Ryr3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.