Rock-2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400468-ACT

ROCK2 (Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 2) codifica Rock-2, una chinasi serina/treonina che funge da principale effettore di RhoA nella regolazione della contrattilità actina–miosina. Rock-2 fosforila substrati tra cui la catena leggera della miosina e le chinasi LIM per controllare la formazione delle fibre di stress, la dinamica delle adesioni focali, la polarità cellulare e la citocinesi, contribuendo così a modellare la migrazione cellulare e l’architettura dei tessuti. Attraverso questi effetti sul citoscheletro, ROCK2 integra segnali di diverse vie legate alla meccanotrasduzione, al rimodellamento della matrice extracellulare e al tono endoteliale e della muscolatura liscia. Una segnalazione di ROCK2 disregolata è stata associata a comportamenti invasivi alterati, disfunzione vascolare, risposte infiammatorie e processi correlati alla fibrosi, rendendolo un nodo ampiamente utilizzato per analizzare fenotipi patologici guidati dal citoscheletro.

Rock-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ROCK2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rock-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ROCK2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ROCK2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rock-2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ROCK2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rock-2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rock-2 nelle cellule tumorali con espressione di ROCK2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.