RIN1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402551-ACT

RIN1 (Ras and Rab interactor 1) è un effettore di Ras e un fattore di scambio di nucleotidi guaninici (GEF) per Rab5 che coordina la trasduzione del segnale con il traffico endocitico. Collegando RAS attivato alla dinamica degli endosomi precoci dipendente da Rab5, RIN1 influenza l’internalizzazione dei recettori, l’ampiezza della segnalazione MAPK a valle e i processi di rimodellamento del citoscheletro che determinano migrazione e adesione cellulare. RIN1 interagisce anche con le chinasi della famiglia ABL e con reti di proteine adattatrici, collocandosi in vie che regolano il traffico di membrana e le risposte dipendenti dall’actina. Un’espressione deregolata di RIN1 o un contesto di segnalazione alterato sono stati associati a modifiche nel turnover dei recettori per i fattori di crescita e a comportamenti di segnalazione oncogena, rendendolo rilevante per studi meccanicistici in biologia del cancro e nella segnalazione cellulare.

RIN1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RIN1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RIN1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RIN1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RIN1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RIN1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RIN1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RIN1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RIN1 nelle cellule tumorali con espressione di RIN1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.