Rac 2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401157-ACT

RAC2 codifica Rac2, una piccola GTPasi della famiglia Rho arricchita nelle cellule ematopoietiche, che alterna ciclicamente gli stati legati a GDP e a GTP per coordinare il rimodellamento del citoscheletro di actina, la polarità cellulare e il traffico di membrana. Rac2 agisce a valle della segnalazione mediata da immunorecettori, integrine e chemochine per regolare l’attivazione della NADPH ossidasi, la produzione di specie reattive dell’ossigeno e le risposte antimicrobiche dei fagociti, influenzando inoltre gli output di segnalazione dipendenti da MAPK e PI3K. Nei leucociti, Rac2 supporta chemotassi, adesione, degranulazione e la dinamica della sinapsi immunologica, collegando il controllo del citoscheletro alle vie infiammatorie e dell’immunità innata. Un’attività o un’espressione disregolata di RAC2 è stata associata ad alterazioni della difesa dell’ospite e dell’omeostasi immunitaria, rendendolo rilevante per lo studio dei meccanismi di immunodeficienza, dei fenotipi infiammatori e della segnalazione nelle cellule ematologiche.

Rac 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RAC2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rac 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RAC2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RAC2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rac 2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RAC2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rac 2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rac 2 nelle cellule tumorali con espressione di RAC2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.