Rab 9B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-412147-ACT

RAB9B codifica la piccola GTPasi Rab9B, un membro della famiglia RAB che coordina la dinamica del traffico vescicolare attraverso un ciclo regolato GDP/GTP. Rab9B è coinvolta nel trasporto dal tardo endosoma alla rete trans-Golgi e nella maturazione endosomiale, processi che influenzano la consegna ai lisosomi, il turnover dei recettori di membrana e l’omeostasi complessiva del sistema endomembranoso. Modellando lo smistamento intracellulare e il traffico retrogrado, l’attività di RAB9B può modulare l’output di segnalazione e la funzione degli organelli in tipi cellulari con elevato flusso di membrana. La disregolazione delle vie di traffico endolisosomiale è ampiamente rilevante negli studi su neurodegenerazione, biologia delle infezioni e adattamento delle cellule tumorali, rendendo RAB9B un nodo utile per indagini meccanicistiche.

Rab 9B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RAB9B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rab 9B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RAB9B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RAB9B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rab 9B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RAB9B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rab 9B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rab 9B nelle cellule tumorali con espressione di RAB9B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.