Rab 7 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422571-ACT

Rab7 codifica Rab7, una piccola GTPasi che regola la maturazione degli endosomi tardivi, il traffico endosoma–lisosoma e il posizionamento dei lisosomi attraverso il reclutamento coordinato di effettori che controllano la motilità delle vescicole e la fusione di membrana. Nelle cellule di topo, Rab7 è un elemento centrale del flusso autofagico, poiché favorisce la fusione tra autofagosoma e lisosoma e supporta la degradazione del carico endocitico, contribuendo così a modulare il turnover dei recettori e le vie di sensing dei nutrienti. L’alterazione del traffico dipendente da Rab7 perturba l’omeostasi lisosomiale e può influenzare la processazione dell’antigene, il controllo di qualità mitocondriale e la segnalazione neuro-immune. Un’attività di Rab7 modificata è stata collegata a meccanismi patologici che coinvolgono neurodegenerazione, neuropatia periferica e biologia delle infezioni, tramite difetti nel traffico intracellulare e nelle vie degradative.

Rab 7 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Rab7 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rab 7 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Rab7 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Rab7, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rab 7. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Rab7 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rab 7 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rab 7 nelle cellule tumorali con espressione di Rab7 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.