Plásmido CRISPR de Activación (m) Rab 7: sc-422571-ACT

Rab7 codifica Rab 7, una pequeña GTPasa que regula la maduración del endosoma tardío, el tráfico endosoma–lisosoma y el posicionamiento de los lisosomas mediante el reclutamiento coordinado de efectores que controlan la motilidad de vesículas y la fusión de membranas. En células de ratón, Rab 7 es clave para el flujo autofágico al promover la fusión autofagosoma–lisosoma y apoyar la degradación de la carga endocítica, moldeando así el recambio de receptores y las vías de detección de nutrientes. La alteración del tráfico dependiente de Rab7 perturba la homeostasis lisosomal y puede influir en el procesamiento de antígenos, el control de calidad mitocondrial y la señalización neuroinmunitaria. Los cambios en la actividad de Rab7 se han vinculado a mecanismos patológicos que implican neurodegeneración, neuropatía periférica y biología de infecciones, debido a defectos en el tráfico intracelular y en las vías degradativas.

Rab 7 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Rab7 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Rab 7 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Rab7 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Rab7, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Rab 7. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Rab7 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Rab 7 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Rab 7 en células tumorales con expresión de Rab7 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.